bbin

技术文章

免疫组化点击次数:481 发布时间:2019-08-09

                                                              免疫组化
 

bbin   OUMEIGUOJIAXIANGJIKAIZHANLEMIANYIZUHUAZHILIANGKONGZHIGONGZUO,JIANLILEYITAOBIJIAOWANSHANDEZHILIANGKONGZHIFANGFAHECHENGXU。ZHONGGUOBINGLIGONGZUOZHEWEIYUANHUI(CCP)MIANYIZUHUAYANJIUZHONGXINJIEJIANGUOWAIDEXIANJINJINGYANBINGJIEHEWOGUODANGQIANDESHIJIQINGKUANGKAISHITANSUOYIZHONGSHIHEWOGUOMIANYIZUHUAZHIKONGDEFANGFA,TONGSHI,FAXIANHETUIGUANGBIAOZHUNHUADERANSECHENGXU,GAISHANHETIGAOMIANYIZUHUASHIYANDEKEKAOXING,SHIMIANYIZUHUAJISHUGENGJUBIAOZHUNHUA,MIANYIZUHUAJIEGUOGENGJUKEKAOXINGHEZHONGFUXING。JINGUANMIANYIZUHUAZAIXUDUOSHIYANSHIZHONGYICHANGGUIKAIZHAN,DANTASHIYIGEDUOBUZHOU、DUOYINSUJUEDINGDEYIZHONGSHIYANFANGFA,YOUYUGESHIYANSHICAIYONGDEXIUFUFANGFA、RANSEFANGFA、SHIJICHANGJIA、KANGTIKELONGHAO、JIANCEXITONGDENGYOUSUOBUTONG,RANSEJIEGUOHUICHUXIANJIAODACHAYI,XIANGDANGBUFENDESHIYANSHIDUIMIANYIZUHUABIAOZHUNHUADERENSHISHANGQIANZUGOUZHONGSHI, ZHISHIBULIANGDERANSEJIEGUODUIBINGLIZHENDUANYINQIWUDAO,YINCIMIANYIZUHUARANSEJIEGUODEKEKAOXINGSHOUDAOLEJIDADEGUANZHU。

 

bbin       ZAISHIJIGONGZUODANGZHONGYOUXUDUOYINSUYINGXIANGZHEMIANYIZUHUADEJIEGUO,BAOKUOJISHURENYUANSHIFOUSHULIANZHANGWOZHENGGESHIYANDECAOZUOCHENGXU、KANGTIDETEYIXING、FANGFADEMINGANXING、BIAOBENDEGUDING、ZUZHIDECHULI、SHIFOUJINXINGKANGYUANXIUFU、XIUFUYEDEPHZHIDENGDENGYINSU。WEILERANGMEIGESHIYANSHINENGGOUCHIXUWENDINGDIWANCHENGKEKAODESHIYANRANSEJIEGUO,YINGDANGJIANGMIANYIZUHUARANSEJISHUZHONGDEQUANBULIUCHENGNARUBIAOZHUNHUA。

 

   一、 免疫组化成功的要素

   BINGLIKEYISHENGYAOYOUXIANGDANGDEMIANYIZUHUAZHENDUANZHISHIHEMIANYIZUHUAJISHUJINGYAN,YAOQINGCHURENSHIMIANYIZUHUAJISHUSHIYIMENSHIYANXING、JISHUXINGFEICHANGQIANGDEJISHU,YAODUOLEJIEDUOZHONGKANGTIZAIZUZHIZHONGDEBIAODAQINGKUANG,YIJIYINGXIANGMIANYIZUHUAJIEGUODEGEZHONGYINSU,ZHIYOUTIGAOYISHENGDEMIANYIZUHUAZHENDUANSHUIPINGCAINENGBIMIANCUOWUDEPANDUAN,CAINENGQUEBAOMIANYIZUHUAZHENDUANDEZHUNQUEXING。BINGLIJISHURENYUANSHIMIANYIZUHUASHIYANCHENGGONGDEGUANJIANYINSU,CAOZUORENYUANYAOYOUFENGFUDEMIANYIZUHUADELILUNZHISHIJISHULIANDEMIANYIZUHUARANSEJISHU,SHIFENQINGCHUMEIYIGEBUZHOUDEYINGYONGYUANLI,SHISHIYANJIEGUOGENGJUKEKAOXING。KEKAODESHIYANSHIJIHESHIYANFANGFASHIMEIGESHIYANSHIDEBIBEITIAOJIAN。YOUYUSHIYANFANGFADUOZHONGDUOYANG,KANGTIDEPINZHONGFANDUO,MEIGESHIYANSHIDOUYINGDANGQUEBAOGAOZHILIANGJIADESHIJI,BINGMOSUOCHUzuiJIADESHIYANTIAOJIAN。DEMIANYIZUHUAQUJUEYUYOUXIAODEKANGYUANXIUFU、MINGANDEJIANCEXITONG、HESHIDESHIYANZHIKONGDUIZHAOJISHULIANHEYOUZERENXINDEJISHURENYUAN。

 

   二、免疫组化染色前处理技术操作规范

   1.取材bbin:理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm,大多数实验室都认为组织在加热抗原修复过程中造成脱片的主要原因是取材过厚或脱水浸蜡处理不当所致。良好的取材、固定、脱水过程是免疫组化质控的前提,如果H&E切片都做不出满意的染色结果,那么免疫组化染色也将无从谈起,根本无法保证染色质量。

   2.固定:在众多的组织固定液中(如甲醛、乙醇、戊二醛、多聚甲醛 等),不同的实验方法在使用上各有千秋。但在保持组织细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性以及试剂的价格上,福尔马林是zui好、既经济又通用。而含酸或含汞的固定液对抗原保存均不理想。组织离体后固定一般不要超过30分钟,在常温条件下固定时间为8-24小时。同时还要注意避免福尔马林过度固定造成的组织抗原丢失,有研究发现新鲜组织经过福尔马林一周固定后组织抗原丢失严重,抗原几乎不能被检测,因为组织固定后会引起蛋白或蛋白分子之间形成交联,导致抗原位点遮盖,可以通过抗原修复方法来修正,若加抗体前不采用抗原修复,则免疫组化染色常不能到达理想结果或不成功。组织同样不能长时间放置在70%的乙醇中,酒精固定后的组织形态不如福尔马林固定的组织。脱钙液对抗原破坏较为严重,因此在组织脱钙前zui好在福尔马林液中固定48小时,若组织没有固定透则酸会破坏抗原,脱钙液中酸的浓度与脱钙时间都必须尽量控制在zui低的限度。

   3.浸蜡:我们认为浸蜡温度应控制在58~60℃左右,浸蜡用的石蜡应经常更换,以减少石蜡中二甲苯的含量。高温下的二甲苯容易使组织发脆,细胞收缩,更容易掉片。

   4.切片厚度bbin:用于免疫组织化学染色的切片厚度为3-4微米。为防止在染色过程中脱片,需要使用硅化玻片裱片。

   5.硅化玻片的制备:载玻片经酸洗冲洗干净后烤干; 2%APES丙酮或无水酒精中浸泡1~2min;丙酮或无水酒精洗1~2分钟;蒸馏水浸洗1~2min;烤干备用。

   6.烤片:切片在60℃~65℃烤箱中烤片30-60分钟左右。有些实验室采用烤片过夜。有报导烤片温度超过60℃时,烤片时间超过18小时的切片,免疫组化染色强度比烤4小时的切片要略弱。温度过高或时间过长均会影响抗原的活性,原因是在高温干燥条件下可以加速组织切片中抗原的氧化。

   7.切片保存bbin:一些实验室研究人员习惯将组织蜡块连续切片后长期保存在室温条件下,切片后的组织在室温下长期保存抗原可以损失。迈新实验室在实验中发现蜡块切片后,在室温下保存三个月以上,免疫组化染色结果会出现减弱或阴性情况。并进行了新、旧切片的保存时间对照实验,选择11种不同组织蜡块每例连续切片10片,共110片,常温空气中放置一个月、三个月、半年、一年与新切片进行成对对照实验。实验结果表明:组织蜡块切片后在室温下保存三个月,抗原对多数抗体的敏感性约下降一半,部分切片丢失更多。切片保存半年多数的抗体不能出现阳性标记结果,保存一年以上仅有个别的切片能够有微弱的阳性表达,尤其核表达的抗原丢失更为突出。国外也有类似的资料报道。其原因可能与空气中的氧化作用有关,所以在实际工作可以采用蜡封切片来避免抗原损失以便长期保存,也可4℃冰箱冷藏保存,尤其是用于科研集中实验的切片更应注意切片的保存。

   8.脱蜡:免疫组化的脱蜡步骤与常规H&E脱蜡步骤相同,免疫组化实验室中脱蜡需与H&E常规脱蜡分离,以保证脱蜡彻底,否则可能导致染色结果的异常。

 

   三、免疫组化实验中的抗原修复

   1.酶消化:如胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白水解酶

   2.抗原热修复:高压法、微波法、水煮法

bbinZHONGSUOZHOUZHI,MIANYIZUHUARANSEZHONGzuiGUANJIANDEMOGUOYUKANGYUANXIUFU,ERJUEDADUOSHUCHANGYONGKANGTIDEXIUFUSHITONGGUOJIARELAIWANCHENGDE,REKANGYUANXIUFUYOUYUMEIXIAOHUA,GENGYOUXIAO,RANSEJIEGUOGENGYIYIZHI,CAOZUODANYI。

   3.修复时间bbin:既要获得zui强的染色结果,又要保持组织形态的完整性。许多抗原修复存在的问题是组织固定时间过短时,强烈的抗原修复可引起形态破坏、脱片及组织完全消化,解决的方法可采用较短时间的热修复或减少酶的消化时间。

   4.抗原修复缓冲液:有柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)、 Tris (pH7-8)、EDTA(pH8.0~9.0) 、 EGTA(pH9.0) 等,柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)的优点是染色背景清晰,适合于大多数抗体,Tris和 EDTA两种修复液对部分抗原修复效果较强,但其染色背景同时加深,如使用不当易造成假阳性结果的判断。目前还没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体,柠檬酸缓冲液(pH6.0)可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液,但也不能除外某些抗体适用于EDTA和EGTA缓冲修复液,一般抗原比较难于表达的抗体多选择高pH值的修复液。例如:ER、PR、Bcl-2、Bcl-6、TdT、Ki-67、Cyclin D1等。

   5.抗原热修复注意事项:无论哪一步都不要让切片干凅,加热后需要冷却15-30分钟。充分的抗原修复是影响染色结果的*重要因素,加热的温度和时间可导致修复不足或过度修复。

   6.抗原热修复对组织中内源性生物素的影响bbin:抗原热修复在增强抗原决定簇表达的同时,也增强了组织中内源性生物素的反应。采用卵白素-生物素(Avidin-biotin)检测系统,组织中内源性生物素容易出现人为假象,在加热抗原处理条件完全相同的阴性对照片中可以观察到较强的内源性生物素的反应,没有经过热抗原处理的切片中没有出现类似的情况。在细胞浆中呈均一的细颗粒状的浅棕色阳性,有时表达也非常强,与真阳性的结果表达很相似,在以往的免疫组化染色中内源性生物素的影响对诊断造成许多的误差,却常常被忽略。值得提醒的是在概念上一定要十分清楚,阴性对照片必须与一抗的抗原修复处理条件完全相同,才能准确发现内源性生物素出现的部位。

   7.内源性生物素封闭方法bbin:一般在抗原修复以后,加抗体前使用卵白素进行生物素阻断处理,也可使用非生物素的检测系统,如:EliVision、EnVision、SuperVesion等。

 

   四、免疫组化染色实验操作规范

   1.脱蜡:二甲苯 ――→ 酒精 ――→ 蒸馏水

   3.血清封闭bbin:在加入一抗前需用二抗的正常血清进行封闭,可以减少非特异性结合。目前使用的二步法检测系统可以免去这一步骤。

   4.抗体使用:已有大量的即用型抗体供实验室使用,厂家已进行过多次的实验检测,可按厂家提供的条件进行操作。浓缩型抗体一般按照厂家提供的建议稀释度,进行对倍稀释预实验。选定zui佳的稀释滴度后再进行批量实验。染色背景深大多是抗体浓度过高所致。抗体孵育温度一般以常温25℃为基准或37℃30分钟,也可4℃冰箱过夜。

   5.冲洗:常用的冲洗液为PBS或TBS缓冲液,要严格执行冲洗步骤,防止因冲洗不净引起的背景着色,缓冲液中加入Tween20可以增强冲洗效果。

   6.检测系统:通用的检测系统有生物素标记的ABC、SP、LSAB等,此类检测系统较为经济,日前仍有不少医院在使用。非生物素类检测系统价钱较贵,由于不需通过生物素的结合,可以避免内源性生物素的干扰,其特点:敏感、省时、方便、背景低。

   7.显色系统:由于检测系统采用的是辣根过氧化物酶,因此选择DAB(棕色)和AEC(红色)作为酶的底物,若采用碱性磷酸酶系统则选择BCIP/NBT(蓝紫色),常规免疫组化显色的仍然是DAB,定位清晰,易于保存。AEC不能耐受酒精及敏感性低,BCIP/NBT阳性虽鲜艳,但阳性定位不准确。

   8.复染:衬染步骤十分简单,但衬染的好坏对染色zui终结果的质量影响很大。有的选用Harris苏木素,有的用Mayer’s苏木素,且与DAB染色对照效果zui好,在绝大多数实验室中使用简单方便。也有实验室使用甲基绿衬染衬染,但不能经有机溶剂,容易退色。

 

   五、染色结果的观察

   1.阳性结果应定位在细胞相应的部位,在细胞膜表达的抗原阳性结果应定位在细胞膜上,在其他部位
的阳性反应均为非特异性染色。不当的抗原修复会导致抗原在组织细胞中定位的改变。根据所检测抗原的不
同,抗原分别定位在:

(1)XIBAOMO:RULCAHECD3、CD20DENG;

bbin(2)XIBAOZHI:RUCytokeratin 、GFAP、S100 、CgA、AFPDENG;

bbin(3)XIBAOHE:RUKi-67、ER、PR、TTF-1、HPV-Ag、Cyclin D1、TDTDENG。

   2.ZUZHIDEZHOUBIAN、QIPAO、DAOHEN、ZHOUZHEDENGBUWEIWANGWANGCHENGXIANFEITEYIXINGYANGXINGBIAODA。

   3.RANSEJIEGUOCHENGYINXINGBINGFEIDOUSHIKANGYUANBUBIAODA,YAOKAOLVSHIFOUYUZUZHIZHONGDEKANGYUANSHOUDAOPOHUAIYOUGUAN。

bbin   4.ZUZHIQIEPIANBEIJINGSHENYUXIALIEYINSUYOUGUAN:

(1)SHILAQIEPIANTUOLABUGANJING;

(2)*KANGTINONGDUGUOGAOHUOFUYUSHIJIANGUOZHANG,WENDUGUOGAO;

bbin(3)XIANSEJIDABNONGDUGUOGAOHUOH2O2TAIDUO;

(4)KANGTIBUCHUN;

bbin(5)KANGTIFUYUHOUQIEPIANQINGXIBUGANJING。

 

   六、免疫组化实验对照

   WEIZHENGSHIKANGTIHEJIANCESHIJIHEXIAOJIASHIFOUKEKAO,RANSECAOZUOSHIFOUZHENGQUE,YIBANXUYAOJINXINGSHIYANDUIZHAO,YIBIMIANSHIJISHIXIAOHUOCAOZUOSHIDANGERCHUXIANJIAYINXINGHEJIAYANGXING,QUEBAORANSEJIEGUODEKEKAOXING。

   1.阳性对照bbin:选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色,阳性切片应呈阳性,此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。

   2.阴性对照bbin:选用已知染色阴性的组织切片染色,其结果应为阴性。每次实验中增加Vimentin染色作为对照,目的是观察组织经福尔马林固定后预期抗原表达的敏感性,按福尔马林固定后抗原损伤的程度来进行分析。Vimentin几乎在任何组织中都有表达,尤其适合活检组织中的免疫组化染色观察。在与上皮组织相连接的间质中存在着大量的血管Vimentin可阳性表达,如果在同一张切片的间质中出现Vimentin染色微弱或部分区域变弱的情况,表明是不当的固定导致抗原破坏。所以在每批次实验中应常规加入Vimentin染色,用于指导观察福尔马林固定后抗原表达敏感性情况。

 

   七、抗体的保存和稀释

   YIBANLAISHUO,KANGTIYINGFANGZAI4℃BINGXIANGZHONGBAOCUN,*KANGTIKEFENCHENGXIAOBAOZHUANGYU-20℃BAOCUN,SHIYONGSHICUNFANGZAI4℃,BUYIFANFUCUNFANGYU4℃HE-20℃ZHIJIAN,FANFUDONGRONGHUISHIKANGTIXIAOJIAXIADIE。JIANCEXITONGYIBANBUYIYU-20℃BAOCUN,YINWEIFANFUDONGRONGSHIDEYUKANGTIJIEHEDEMEIRONGYIFENJIE,DAOZHIJIANCEDEMINGANDUJIANGDI。NONGSUODEKANGTIZAIRANSEQIANYINGGENJUSHUOMINGSHUYAOQIUHUOZIXINGMOSUOCHUDEzuiJIAGONGZUONONGDUJINXINGXISHI。KEJIANGKANGTIXISHIZHI1:10,RANSEQIANZAIXISHICHENGGONGZUOYE。NONGSUOYEKANGTIBAOCUNDESHIJIANJIAOZHANG,FANZHIXISHIHOUDEKANGTIBAOCUNDEQIXIANJIAODUAN,RUSHIYONGJIYONGXINGKANGTI,JINGGUOYIDINGSHIJIANHOUYINGZHUYIQIXIAOJIASHIFOUYOUSUOJIANGDI,BIMIANCHUXIANJIAYINXINGRANSE。

   Nestin、PDGFR KEYONGYUWEICHANGJIANZHILIUDEZHENDUANZHIBIAO,YOUQIDUICD117YINXINGWEICHANGJIANZHILIUZAIZHENDUANSHANGYOUHENDADEBANGZHU,ZAIGUOWAIYIYOUWENXIANBAODAO。ZHEILIANGZHONGKANGTIKEYONGYUCHANGGUIGUDINGDESHILAQIEPIAN,JINGSHIYANZHENGMINGNestin YONGPH8.0 EDTAGAOYAXIUFU,PDGFRYONGPH6.0 NINGMENGSUANWEIBOXIUFUXIAOGUOJIAOHAO。

 

电话:
13788993509
13788995069
021-64133189
传真:
021-64129208
陈小姐
徐小姐
朱小姐
 
安全联盟站长平台

推荐收藏该企业网站
扫一扫访问手机站
访问手机站